Annexin V

　　在正常细胞中，磷脂酰丝an酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝an酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝an酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝an酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

　　操作步骤：

　　贴壁细胞需用0.25%的yi酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2％的BSA可防止消化过度。如果用含EDTA的yi酶消化时，注意必须清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×binding buffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响Annexin V的结合。

　　（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；

　　（2）细胞收集：悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的yi酶消化收集后（注：yi酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝an酸与Annexin V-FITC的结合），在室温中，2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；

　　（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，弃上清洗涤细胞；

　　（4）加入300μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；

　　（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；

　　（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。

　　（7）上机前，补加200μL的1×Binding Buffer。

　　注意：每个反应体系建议细胞数为1×104至1×106个

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